常見問題

  • 【知識科普】核酸提取的常用方法及原理

    目前常用的核酸提取方法有兩種:一種是柱式提取,另一種是磁珠法提取。其中自動化提取的實現主要依賴于磁珠法。


    柱式提取是用于微量核酸提取的較為簡單的方法,屬于硅吸附方法的一種,市場上的離心柱雖各有特色,但在原理上通??煞譃槿齻€部分:

    (1)利用裂解液促使細胞破碎,使細胞中的核酸釋放出來。

    (2)把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上,這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力,對其他生化成分如蛋白質、多糖、脂類則基本不吸附,因而在離心時被甩出柱子。

    (3)把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來,分離得到純化的核酸。


    (柱式法圖解)


    磁珠法提取運用納米技術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結合。利用氧化硅納米微球的超順磁性,在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下,能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來,可應用在臨床疾病診斷、輸血安全、法醫學鑒定、環境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學研究等多種領域。



    (機器自動化磁珠法圖解)


  • 【核酸提取常見問題】核酸提取量過少是什么原因導致的?如何解決?

    核酸提取量過少,主要原因及解決措施如下:


    原因一:實驗材料不佳或量少。

    解決方法:盡量選用新鮮(幼嫩)的材料。

     

    原因二:材料破壁或裂解不充分。

    解決方法:動植物要勻漿研磨充分;G+菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁;高溫裂解時,時間適當延長(對于動物細胞、細菌可增加PK的用量)。

     

    原因三:沉淀不完全。

    解決方法:(1)低溫沉淀,延長沉淀時間。(2)加輔助物,促進沉淀。


    原因四:洗滌時DNA丟失。

    解決方法:洗滌時,最好用槍頭將洗滌液吸出,勿傾倒。


  • 【核酸提取常見問題】DNA降解是什么原因導致的?如何避免?

    DNA降解,主要原因及解決方法如下:


    原因一:材料不新鮮或反復凍融。

    解決方法:盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復凍融。

     

    原因二:未很好抑制內源核酸酶的活性。

    解決方法:(1)液氮研磨或勻漿組織后,應站在解凍前加入裂解緩沖液。

                     (2)在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量。

     

    原因三:提取過程操作過于劇烈,DNA被機械打斷。

    解決方法:細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔。

     

    原因四:被外源核酸酶污染。

    解決方法:所有試劑用無菌水配制,耗材經高溫滅菌。

     

    原因五:反復凍融。

    解決方法:將DNA分裝保存在緩沖液中,避免反復凍融。


  • 【PCR實驗常見問題】無擴增產物(假陰性)的可能原因及解決方法有哪些?

    無擴增產物(假陰性)的可能原因及解決方法一覽表

    序號

    可能原因

    解決方法

    1

    模板含有抑制物或模板含量低

    純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量

    2

    Buffer對樣品不合適

    更換Buffer或調整濃度

    3

    引物設計不當或者發生降解

    重新設計引物(避免鏈間二聚體和鏈內二級結構)或者換一管新引物

    4

    反應條件:退火溫度太高,延伸時間太短

    降低退火溫度、延長延伸時間



  • 【PCR實驗常見問題】為何空白對照會出現目的擴增產物(假陽性)?如何避免?

    空白對照出現目的擴增產物,屬于出現了靶序列或擴增產物的交叉污染,為避免這種情況發生,應注意以下幾點:


    (1)實驗操作時小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。


    (2)除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。


    (3)各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存。


  • 【ELISA實驗常見問題】試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,可能原因及解決方法有哪些?

    試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,常見原因以及解決方法如下:


    (1)可能原因:漏加或者誤加試劑;

    解決方法:檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應核對標簽。


    (2)可能原因:試劑過期;

    解決方法:使用有效期內的產品。


    (3)可能原因:洗板液配制中出現問題,如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉等);

    解決方法:使用干凈的器皿,正確配制試劑。


    (4)可能原因:溫育的時間或溫度不夠;

    解決方法:校正溫育箱溫度。


    (5)可能原因:標準品失活或者丟失;

    解決方法:標準品正確保存、溶解和混勻。


    (6)可能原因:抗體失活或者丟失;

    解決方法:更換抗體或者提高抗體濃度。


    (7)可能原因:酶失活或者丟失;

    檢查方法:把工作濃度的酶再稀釋20-100倍,取5uL加入50ul的顯色底物,終止后顯色是否能達到1.0左右,此為酶的粗略估計。

    解決方法:更換酶或者提高酶的濃度。


    (8)可能原因:顯色底物失活;

    檢查方法:加少量的工作濃度的酶,TMB是否很快顯色。

    解決辦法:更換顯色底物。

  • 【ELISA實驗常見問題】實驗結果空白背景高,是什么原因造成的?如何解決?

    ELISA實驗結果空白背景高,常見原因如下:


    (a)可能原因:洗板不干凈;

    解決方法:充分洗滌,徹底拍干;洗板要防止交叉污染;濃縮洗液準確配制;吸嘴盡可能一次性使用;加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染。


    (b)可能原因:顯色液變質或者試劑過期;

    解決方法:檢查試劑盒有效期。


    (c)可能原因:試劑稀釋有誤,如加酶的濃度過高;

    解決方法:請按說明書所示稀釋倍數配制;


    (d)可能原因:蒸餾水受酶等污染;

    解決方法:使用新鮮蒸餾水。


    (e)可能原因:試劑混用;

    解決方法:不同批號試劑勿混用。


    (f)可能原因:培養箱溫度超過37℃或反應時間過長;

    解決方法:顯色反應時間適當縮短。


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