知識科普|獸醫生物制品中常用滅活劑和凍干保護劑研究進展

  • 發布時間:2022-04-08
  • 文章來源:萊孚生物

滅活劑是指能致死細菌或病毒,使其失去復制能力或致病力(毒力)的化學物質。凍干保護劑是指冷凍真空干燥的生物制品中抗原活性物質以外的添加物。滅活和凍干對生物制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、穩定性和保存期影響較大。不同滅活和凍干技術的原理并不同,需根據微生物類型和制備目的,針對性選擇適用的滅活劑和凍干劑。

(一)滅活劑

生物制品意義上的滅活是指利用物理或化學方法,破壞微生物生物學活性,使其喪失繁殖能力和致病能力,但仍然保留反應原性和免疫原性的過程。目前多用化學方法進行微生物的滅活,用來滅活的化學試劑或藥物等稱為滅活劑( inactivator ) 。使用化學滅活劑進行滅活是制備滅活疫苗最重要的手段,化學滅活劑的滅活效能與使用劑量、滅活時間、滅活時的溫度及溶液的pH等都與滅活疫苗的質量密切相關。


1.β-丙內酯

β-丙內酯(BPL)對病毒有較強的滅活作用,其作用機制不是直接作用于殼蛋白,而是通過改變微生物核酸結構達到滅活的目的。大劑量BPL是一種潛在的致癌物,但其極易水解。BPL滅活周期短,經濟效益高,但相較甲醛價格較高;對病毒有較強的殺滅作用,低質量濃度的BPL(2~4mg/L)可以破壞病毒核酸,但不改變病毒蛋白質。試驗結果顯示:BPL對禽流感病毒的最佳滅活條件為1:3000滅活24h,或1:1000滅活18h;對H9N2亞型AIV滅活能力強,對血凝素影響小,易水解成無害無殘留產物;分別以BPL、甲醛為滅活劑制備H9N2亞型AIV滅活疫苗,免疫SPF雞和廣西土雞,其免疫效果接近。


2.甲醛

甲醛是最古典和應用最廣的滅活劑。早在1911年,Lowenstein和Eisler就開始用甲醛處理破傷風毒素。1924年,Puntoni以0.1%甲醛制成犬瘟熱疫苗。甲醛為無色氣體,易溶于水和乙醇,水溶液稱為福爾馬林,通常濃度為36%-40%,有強烈的刺激性。長期低溫或受凍保存,可以聚合而成三聚甲醛或多聚甲醛。

甲醛對微生物核酸和蛋白都有破壞作用。甲醛可與核酸中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含氨基堿基結合,使微生物核酸變性;與微生物蛋白的氨基結合形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物,后者與酰胺交聯,使微生物蛋白變性,從而阻止其核酸逸出。甲醛滅活微生物也存在一些缺點:作用于病毒殼蛋白時,容易與酰胺交聯形成屏障而使作用于核酸的效率下降,導致滅活周期較長;滅活效果容易受到溫度、pH、微生物種類、濃度的影響;具有致癌性,會使機體產生刺激反應。甲醛對單鏈核酸最有效,因此常被用來滅活RNA病毒。適當濃度的甲醛可使被滅活微生物的抗原性和血凝性保持不變。根據AIV滅活試驗,發現用0.1%的甲醛滅活AIV16h后,病毒全部死亡,18h為最佳滅活時間。


3.烷化劑

烷化劑(alkylating agent)是含有烷基的分子中去掉一個氫原子基團的化合物,它能與另一種化合物作用,將烷基引入,形成烷基取代物。這類化合物的化學性質活潑,其滅活機制主要在于烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等,引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯,妨礙RNA的合成,從而抑制細胞的有絲分裂。也可與酶系統和核蛋白起作用而干擾核酸的代謝。

烷化劑主要包括二乙烯亞胺(BEI)、乙?;蚁﹣啺罚ˋEI),是常用滅活劑,化學性質活潑。烷化劑可以與蛋白質相互作用,破壞蛋白質高級結構,使病毒完全喪失傳染性,但不損傷表面結構蛋白,從而保留其抗原性,因此是制備滅活病毒疫苗的良好滅活劑。目前,用BEI滅活制備的疫苗已使用于動物中,尚未在動物體內發現BEI殘留。烷化劑作為滅活劑,對生產成本、保存條件要求較高,對細菌滅活效果一般。

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(二)凍干保護劑

在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥和儲藏過程中,很多因素(如化學成分、凍結速率、凍結和脫水應力、玻璃化轉變溫度、干燥固體中剩余水分、儲藏環境的溫度和濕度等)都會影響其中活性組分的穩定性,甚至會導致失活。大量的實驗研究表明,除了一些食品、人血漿、牛奶等少數物料可以直接冷凍干燥外,大多數的藥品和生物制品,都需要添加合適的冷凍干燥保護劑和添加劑,配制成混合液后,才能進行有效的冷凍干燥和儲藏。按保護劑功能和性質分類可分為:凍干保護。即在凍結和干燥過程中,可以防止活性組分發生變性的物質;填充劑。能防止有效組分隨水蒸汽一起升華逸散,并使有效組分成形的物質;抗氧化劑。用作防止生物制品在冷凍干燥過程以及儲藏過程中發生氧化變質的物質;酸堿調整劑。在冷凍干燥過程和儲藏過程中,能將生物制品的pH調整到活性物質的最穩定區域的物質。

凍干保護劑的主要作用機制:將病毒凍結,使其中冰晶升華,從而達到低溫脫水,防止活性物質流失結構水的目的,以降低對生物活性的影響;降低胞內外滲透壓差,維持細胞活力;保護或提供病毒恢復所需營養物質,使活性物質自我修復。在選擇凍干保護劑時,要考慮保護核衣殼結構蛋白結構和核酸穩定性。常用的凍干保護劑有糖類、氨基酸、蛋白質和大分子明膠等。碳水化合物和蛋白質是生物制品相關研究中最為常見的兩種保護劑。對多品種生物制品分析發現,因微生物(或抗原蛋白)結構特點各不相同,適用于它的凍干保護技術也不同,所以沒有一種通用于各種生物制品的“萬能”保護劑。 


1.糖類保護劑

糖類在微生物凍干過程中的保護作用機制有兩種假說:一是糖類的羥基在干燥和脫水過程中與蛋白質的極性基團形成氫鍵,進而取代蛋白質上的水分子,形成一層水化膜,防止氫鍵暴露,從而穩定蛋白質的高級結構,維持病毒的抗原性;二是含糖溶液在凍干過程中會玻璃化,而糖類所處的狀態為玻璃態。在玻璃態下,糖類保護劑黏度較高,分子擴散系數較低,因而會將蛋白質分子包裹,形成一種碳水化合物玻璃體,從而維持了蛋白質分子結構,起到保護作用。

研究表明:單糖中,半乳糖的保護效果最佳;二糖的保護效果普遍較好;三糖中的棉子糖對細菌的保護作用最好。另外,海藻糖和蔗糖用作保護劑時效果最好,當使用50g/L的海藻糖時,菌群存活率達到83%左右,當使用100g/L的蔗糖時,存活率達到75%左右。此外,海藻糖分子較小,能填補蛋白質分子的空隙,有效限制蛋白質分子內部結構變化,從而起到保護病毒蛋白外殼的作用。

 
2.氨基酸保護劑

在冷凍過程中,低濃度的甘氨酸可以抑制由于磷酸緩沖鹽結晶所致的pH變化,并防止蛋白質變性。結晶型甘氨酸的主要作用是提升凍干品的塌陷溫度,防止破壞蛋白質結構。常見氨基酸保護劑主要包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、色氨酸、酪氨酸。研究發現,2%谷氨酸鈉、2%L-精氨酸鹽酸鹽、2%D-山梨醇、7.6% 酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明膠、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方,可使豬偽狂犬病病毒凍干保護率達到80.40%。


3.蛋白質保護劑

蛋白質保護劑主要包括脫脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、膠原蛋白,其能夠阻止病毒蛋白質表面吸附,從而對凍干過程中多數蛋白都能起到保護作用。此外,蛋白質可以在微生物細胞外形成保護,在冷凍干燥過程中,蛋白質溶液中的保護劑與蛋白質分子之間相互作用,增加冷凍混合物的玻璃化轉變溫度,大大增加微生物蛋白質的穩定性。采用質量濃度為10.49%脫脂乳與4.22%葡萄糖混合后凍干副干酪乳酸菌,當凍干厚度為0.3cm時,菌體細胞存活率最高,達到94.90%。


小結

滅活和凍干是獸醫生物制品生產中必不可少的技術之一。目前,我國大部分生物制品主要使用甲醛滅活。該方法技術成熟,價格低廉,但使用甲醛作滅活劑存在破壞免疫原性、有致癌風險、滅活時間長等問題,難以適應新型疫苗發展。雖然 新型滅活劑研究也已逐步開展,但大多仍局限于實驗室研究階段。凍干工藝技術直接影響生物制品的保存、運輸和使用。由于不同保護劑的保護機制各不相同,單一保護劑不能滿足微生物抵抗惡劣環境的需求,因此在凍干過程中常采用不同類型的保護劑,按照合適的濃度配比進行協同保護,從而強化保護效果,保證微生物存活率最大化。


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